2021, Vol. 53引用本文 |
2. 四川大学 生物治疗国家重点实验室，四川 成都 610041
2. State Key Lab. of Biotherapy, Sichuan Univ., Chengdu 610041,China
土田七[Stahlianthus involucratus（King ex Bak.）Craib]，别名也叫姜七、三七姜、姜叶三七、竹叶三七，为姜科土田七属植物土田七的块根和根茎。姜科植物是多年生草本植物大家族，种类繁多，是热带和亚热带地区分布最广的植物之一，大约有47属1400种。姜科植物是次生代谢产物的来源，具有丰富的化学结构和重要的生物活性。目前，姜科植物因其植物化学和药理特性被广泛研究，许多姜科植物中分离出多种具有药理作用的活性化合物。
植物土田七，分布于中国的云南、广西、广东、福建等省，在印度也有分布[1]。其味辛、微苦，性温，具有散瘀消肿，活血止血之功效。作为一种民间药，它的根茎长期以来一直用于传统医学中治疗炎症，疼痛和发烧[2]。
根据已有文献报道，目前从土田七中分离得到的化合物包含麦角烷二聚物、倍半萜类、卡丹烷二聚体[3-6]。由于对该植物成分与活性的报道较少，给该药用植物的使用、推广以及鉴定等方面带来较大的困难。为了进一步寻找土田七中化学成分，给土田七的应用奠定物质基础，作者利用半制备型高效液相色谱、柱色谱等多种色谱分离技术对土田七进行分离纯化，并采用质谱和核磁共振波谱鉴定了所得化合物的结构，为土田七的活性研究奠定物质基础。
1 实验部分 1.1 主要仪器与材料Bruker avance 400型核磁共振仪，德国布鲁克公司；QTOF质谱仪和ESI离子源，英国沃特世公司；旋转蒸发仪，瑞典BUCHI R200；半制备型高效液相色谱，美国沃特斯；Water 2695液相色谱仪，美国Waters公司；中压柱层析系统，瑞士Buchi Flawil公司；MCI-gel CHP 20树脂，日本三菱公司；Sephadex LH–20，美国Amersham P-harmacia Biotech公司；柱层析硅胶，德国默克公司。
药材由四川大学生物治疗国家重点实验室胡以国教授提供，采自云南，并鉴定为土田七[Stahlianthus involucratus（King ex Bak.）Craib]。
1.2 提取与分离土田七提取流程图如图1所示。土田七根茎2 kg，经粉碎后，采用60 目的筛网过筛，用75%乙醇（3 L）加热回流提取，每次提取3 h，提取3次合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩得到浸膏412 g。将浸膏用温水（5 L）分散，分别用正己烷（5 L/次）、乙酸乙酯（5 L/次）、正丁醇（5 L/次）3种溶剂进行萃取，每种溶剂萃取3次，将各部分用旋转蒸发仪减压浓缩，得到正己烷部分26 g，乙酸乙酯部分61 g，正丁醇部分146 g。
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| 图1 土田七提取分离流程图 Fig. 1 Flowchart for extraction and isolation of Stahlianthus involucratus |
将正己烷部分（20 g）用硅胶（60～100 目）干法拌样，旋干后进行中压柱层析（100～200 目）分离，用石油醚–乙酸乙酯作流动相进行梯度洗脱（1∶0～0∶1，v/v），每250 mL收集1次，通过TLC（薄层色谱法）进行检测，用旋转蒸发仪将洗脱液分别减压回收溶剂，得到6个组分（Fr.P.1～Fr.P.6）。Fr.P.3（2.69 g）采用中压柱层析（200～300 目），用石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱（50∶1～0∶1，v/v），每50 mL收集1次，通过TLC进行检测，用旋转蒸发仪将洗脱液分别减压回收溶剂，得到5个组分（Fr.P.3.1～Fr.P.3.5）。进一步对Fr.P.3.1用中压柱层析（200～300 目）分离，用石油醚和乙酸乙酯作流动相进行梯度洗脱（50∶1～0∶1，v/v），经TLC检测后得到了4个组分（Fr.P.3.1.1～Fr.P.3.1.4）。Fr.P.3.1.3采用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5 μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（95∶5，v/v）进行等度洗脱，得到化合物1。
将乙酸乙酯部分（50 g）用硅胶（60～100 目）干法拌样，旋干后进行中压柱层析（100～200 目）分离，用石油醚–乙酸乙酯作流动相进行梯度洗脱（1∶0～0∶1，v/v）。通过TLC进行检测，每500 mL收集1次。用旋转蒸发仪将收集的洗脱液分别减压回收溶剂，得到7个组分（Fr.E.1～Fr.E.7）。Fr.E.3（2.3 g）用硅胶（200～300 目）干法拌样，旋干后进行中压柱层析（200～300 目）分离，用石油醚和乙酸乙酯作流动相进行梯度洗脱（40∶1～0∶1，v/v），每100 mL收集1次，通过TLC进行检测，用旋转蒸发仪将收集的洗脱液分别减压回收溶剂，得到6个组分（Fr.E.3.1～Fr.E.3.6）。Fr.E.3.6用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5 μm，4.6×150 mm），在甲醇和水（80∶20，v/v）的条件下等度洗脱，得到化合物8。Fr.E.4（5.9 g）用Sephadex LH–20柱（填料为Sephadex LH–20，50 μm），采用二氯甲烷和甲醇（1∶1，v/v）进行等度洗脱，共得到5个组分（Fr.E.4.1～Fr.E.4.5）。Fr.E.4.3采用SephadexLH–20柱（填料为Sephadex LH–20，50 μm），用二氯甲烷和甲醇（1∶1，v/v）进行等度洗脱，得到9个组分（Fr.E.4.3.1～Fr.E.4.3.9）。进一步采用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5 μm，4.6×150 mm）对Fr.E.4.3.1分离，用甲醇和水（60∶40，v/v）进行等度洗脱得到化合物2。Fr.E.4.3.4采用中压柱层析（200～300 目），用石油醚和乙酸乙酯作流动相进行梯度洗脱（20∶1～1∶1，v/v），共得到5个组分（Fr.E.4.3.4.1～Fr.E.4.3.4.5）。Fr.E.4.3.4.1用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5 μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（60∶40，v/v）作流动相进行等度洗脱，得到化合物4和5。Fr.E.4.3.4.2用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5 μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（55∶45，v/v）作流动相进行等度洗脱，得到化合物3。Fr.E.4.3.4.4利用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5 μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（50∶50，v/v）作流动相进行等度洗脱，得到化合物7。Fr.E.4.3.6利用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5 μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（45∶55，v/v）进行等度洗脱得到化合物6，利用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5 μm，4.6×150 mm）对Fr.E.4.3.7分离，用甲醇和水（45∶55，v/v）进行等度洗脱得到化合物9和10。采用MCI柱（填充材料为MCI–gel CHP 20P，70～150 μm）对Fr.E.7（25.6 g）进行分离，用乙醇和水（1∶3，1∶1，3∶1和1∶0，v/v）进行梯度洗脱得到4个组分（Fr.E.7.1～Fr.E.7.4）。将Fr.E.7.3进一步采用乙醇和水（3∶1～1∶0，v/v）做流动相用MCI柱（填充材料为MCI–gel CHP 20P，70～150 μm）分离，得到5个组分（Fr.E.7.3.1～Fr.E.7.3.5）。最后采用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5 μm，4.6×150 mm）纯化Fr.E.7.3.3，用甲醇和水（35∶65，v/v）进行等度洗脱得到化合物11。
分离纯化所得化合物进一步采用核磁共振波谱鉴定化合物的结构，根据核磁谱图和薄层色谱（TLC）可判定化合物纯度无杂质，纯度较高。
1.3 结构鉴定化合物1：无定型粉末。ESI–MS（m/z）：413.3705（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CDCl3）：δ：5.35（1H，m，H–6），5.15（1H，dd，J=8.4，H–22），5.02（1H，dd，J=8.4，H–23），3.53（1H，m，H–3），2.30～0.64（43H，m）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）：δ：140.77（C–5），138.32（C–22），129.30（C–23），121.72（C–6），71.81（C–3），56.88（C–14），55.98（C–17），51.25（C–24），50.18（C–9），42.32（C–4），42.23（C–13），40.49（C–20），39.70（C–12），37.27（C–1），36.53（C–10），36.16（C–25），31.89（C–8），31.68（C–2），28.92（C–7），25.41（C–15），24.37（C–16），24.31（C–28），21.22（C–21），21.10（C–11），19.41（C–19），18.99（C–26），12.25（C–18），12.06（C–29）11.87（C–27）。以上数据与文献报道[7]一致，故鉴定化合物1为豆甾醇。
化合物2：无定型粉末。ESI–MS（m/z）：253.0641（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：7.40（1H，d，J=3.6，H–2），6.60（1H，d，J=3.6，H–3），6.38（1H，d，J=3.1，H–2′），6.30（1H，d，J=3.1，H–3′），5.40（1H，s，H–7），4.63（2H，s，H–5），4.51（2H，s，H–5′）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：178.06（C–6），161.82（C–4），154.70（C–4′），152.50（C–1），150.65（C–1′），123.43（C–2），109.51（C–3），108.83（C–2′），107.47（C–3′），97.89（C–7），56.25（C–5），55.98（C–5′）。以上数据与文献报道[8]一致，故鉴定的化合物2为5，5′–二羟甲基糠醛。
化合物3：无定型粉末。ESI–MS（m/z）：257.1025（[M+H]+）。1H NMR（400 Hz，CD3OD）：δ：5.98（1H，q，J=6.8，H–2），5.20（1H，s，H–10），4.86（1H，s，H–10），3.02（2H，s，H–4），1.97（1H，s，CH3–12），1.91（3H，d，J=6.8，CH3–1），1.62（3H，s，CH3–7）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：172.39（C–7），170.04（C–11），169.53（C–8），146.38（C–5），138.64（C–2），130.56（C–3），111.61（C–10），82.98（C–6），35.54（C–4），20.94（C–9），19.84（C–12），14.55（C–1）。命名为顺式–6–甲基–5–亚甲基–3–亚乙基–6–乙酰氧基己二酸。
化合物4：无定型粉末。ESI–MS（m/z）：259.1103（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.06（1H，d，J=7.1，H–2），2.61（1H，m，H–4），2.18（1H，m，H–5），2.10（1H，m，H–4），2.09（3H，s，CH3–11），2.02（3H，d，J=7.1，CH3–1），1.72（3H，s，CH3–9），0.82（3H，d，J=7.2，CH3–12）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：173.02（C–10），170.12（C–7），169.77（C–8），138.28（C–2），130.83（C–3），83.49（C–6），35.61（C–4），32.23（C–5），21.02（C–9），19.93（C–11），14.52（C–1），12.11（C–12）。以上数据与文献报道[9]一致，故鉴定化合物4为反式-（2R，3S）–2，3–二甲基–5–亚乙基–2–乙酰氧基己二酸。
化合物5：无定型粉末。ESI–MS（m/z）：217.0154（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.16（1H，d，J=7.6，H–2），2.57（1H，m，H–4），2.28（1H，m，H–5），2.20（1H，m，H–4），2.01（3H，d，J=7.6，CH3–1），1.39（3H，s，CH3–9），0.92（3H，d，J=6.8，CH3–10）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：174.70（C–7），165.42（C–8），145.06（C–2），122.48（C–3），84.69（C–6），34.47（C–4），32.53（C–5），20.67（C–9），15.12（C–1），12.23（C–10）。以上数据与文献报道[10-11]一致，故鉴定化合物5为反式–（2R，3S）–2，3–二甲基–5–亚乙基–2–羟基己二酸。
化合物6：无定型粉末。ESI–MS（m/z）：125.0541（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.93（1H，s，H–2），6.82（1H，d，J=7.5，H–5），6.68（1H，d，J=7.5，H–4），1.96（3H，s，H–1）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：147.90（C–6），145.38（C–3），126.58（C–1），121.33（C–5），115.09（C–4），113.66（C–2），21.33（C–7）。以上数据与文献报道[12]一致，故鉴定化合物6为2，5–二羟基甲苯。
化合物7：无定型粉末。ESI–MS（m/z）：115.0681（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.99（1H，m，H–2），2.43（1H，m，H–4），2.23（1H，m，H–4），1.67（3H，d，J=6.3，H–5），0.88（3H，d，J=7.1，H–1）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：167.98（C–6），141.03（C–3），124.81（C–2），28.51（C–4），12.66（C–5），12.64（C–1）。以上数据与文献报道[13]一致，故鉴定化合物7为2–乙基–2–丁烯酸。
化合物8：无定型粉末。ESI–MS（m/z）：165.0475（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：7.52（1H，d，J=16，H–7），7.34（2H，d，J=8.5，H–2/6），6.73（1H，d，J=8.5，H–3/5），6.18（1H，d，J=16，H–8）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：169.67（C–9），159.76（C–4），145.25（C–7），129.68（C–2/6），125.85（C–1），115.42（C–3/5），114.40（C–8）。以上数据与文献报道[14]一致，故鉴定化合物8为糠酸。
化合物9：无定型粉末。ESI–MS（m/
化合物10：无定型粉末。ESI–MS（m/z）：336.1721（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.16（1H，s，H–2），5.76（1H，q，J=7.2，H–20），5.35（1H，d，J=11.6，H–9），5.26（1H，s，H–7），4.94（1H，s，H–8），4.32（1H，m，H–3），4.14（1H，d，J=11.6，H–9），3.80（1H，m，H–3），3.05（1H，m，H–5），2.48（1H，m，H–6），2.39（1H，m，H–6），2.15（1H，m，H–14），1.75（3H，d，J=7.2，CH3–21），1.72（1H，m，H–14），1.59（1H，m，H–13），1.29（3H，s，CH3–18），0.79（3H，d，J=7.4，CH3–19）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：176.78（C–11），166.78（C–16），135.46（C–20），132.55（C–2），132.39（C–1），130.66（C–15），77.97（C–8），76.80（C–12），73.43（C–7），60.90（C–3），57.94（C–9），52.82（C–5），38.60（C–13），37.95（C–14），33.71（C–6），23.81（C–18），13.89（C–21），9.74（C–19）。以上数据与文献报道[15]一致，故鉴定化合物10为千里光宁碱。
化合物11：无定型粉末。ESI–MS（m/z）：376.1682（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.07（1H，s，H–2），5.98（1H，q，J=7.2，H–20），5.30（1H，s，H–7），5.21（1H，s，H–19），4.97（1H，s，H–19），4.65（1H，d，J=11.6，H–9），4.99（1H，s，H–8），4.44（1H，d，J=11.6，C–9），4.35（1H，m，H–3），3.86（1H，m，H–3），3.81（1H，m，H–5），3.25（1H，m，H–14），3.07（1H，m，H–5），2.87（1H，m，H–14），2.33（1H，m，H–6），1.98（3H，d，J=7.2，CH3–21），1.82（3H，s，H–23），1.65（3H，s，CH3–18）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：170.24（C–11），169.86（C–22），166.20（C–16），145.45（C–13），137.67（C–20），131.46（C–2），130.76（C–1），130.72（C–15），114.97（C–19），82.65（C–12），77.67（C–8），72.86（C–7），60.35（C–3），58.75（C–9），53.35（C–5），36.73（C–14），33.41（C–6），20.65（C–18），19.81（C–21），14.29（C–23）。以上的数据与文献报道[16]一致，因此鉴定化合物11为乙酰化千里光菲林碱。
2 结果与讨论化合物3为新化合物，无定型粉末。质谱数据给出[M+Na]+=279.0841，可确定该化合物的分子式为C12H16O6，不饱和度为5。1H NMR谱数据给出3个烯烃氢信号，分别为[δ（H） 5.98（1H，d，J=6.8，H–2），5.21（1H，s，H–10），4.86（1H，s，H–10）]，2个亚甲基氢信号[δ（H） 3.02（2H，s，H–4）]，9个甲基氢信号[δ（H） 1.91（3H，d，H–1），1.62（3H，s，H–9），1.97（3H，s，H–12）]。
13C NMR谱图显示化合物共12个碳，与高分辨数据对应。13C NMR数据给出1个烯烃上的次甲基和亚甲基信号δ（C） 138.64（C–2）和111.61（C–10），1个亚甲基信号δ（C） 35.54（C–4），3个甲基信号δ（C） 20.94（C–12），19.84（C–9），14.55（C–1），3个羰基信号δ（C） 172.39（C–7），170.04（C–11），169.53（C–8），2个烯烃季碳信号δ（C） 146.38（C–5）和130.56（C–3），1个季碳信号δ（C） 82.98（C–6）。
如表1所示，通过结合13C NMR和HSQC数据可以更进一步的确定C–H关系：δH 5.20（1H，s，H–10），4.86（1H，s，H–10）为末端烯烃双氢，1个孤立的亚甲基信号δH 3.02（2H，s，H–4），1个与次甲基耦合的甲基信号δH 1.91（3H，d，J=6.8，CH3–1），2个甲基信号δH 1.97（1H，s，CH3–12）和1.62（3H，s，CH3–9）。
| 表1 化合物3的核磁数据 Tab. 1 NMR spectral data of compound 3 |
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如图2所示，根据COSY谱可以推断C–2位烯烃与C–1位甲基具有相关性，在HMBC谱中，4–H和5–C、6–C、3–C、8–C以及10–C、2–C，1–C均相关，2–H和1–C、3–C，4–C、5–C、8–C相关，10–H与5–C、6–C、7–C相关，9–H与7–C、6–C、5–C相关，12–H与11–C相关，根据以上分析可以知道该化合物结构与已知化合物4的骨架相似，可以推测出该化合物的基本碳骨架为―CO―C–（＝CH―CH3）―CH2―C（＝CH2）―C（CH3，CH3COO）―CO―，再结合该化合物的分子式可以推断该化合物结构。
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| 图2 化合物3的2D-NMR耦合信息 Fig. 2 2D-NMR correlations of compound 3 |
根据表1，C–2烯烃质子（1H，d，J=6.8 Hz）可推测C–2和C–3之间的烯烃为Z型。根据以上的分析，可以知道该化合物的结构如图3所示，命名为顺式–6–甲基–5–亚甲基–3–亚乙基–6–乙酰氧基己二酸。
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| 图3 化合物3结构 Fig. 3 Structure of compound 3 |
3 结 论
综合运用多种现代色谱分离纯化技术和波谱鉴定技术，从土田七中分离、鉴定出11个化合物，其中化合物3为新化合物顺式–6–甲基–5–亚甲基–3–亚乙基–6–乙酰氧基己二酸，丰富了土田七植物的化学成分研究，为土田七植物的使用和开发提供参考。
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