工程科学与技术   2018, Vol. 50 Issue (2): 226-230
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王万, 廖立东, 干玉娟, 等. UPLC-MS/MS法同时检测大鼠体内7–乙基–14–氨基喜树碱及其代谢产物[J]. 工程科学与技术, 2018, 50(2): 226-230. DOI:10.15961/j.jsuese.201700661
WANG Wan, LIAO Lidong, GAN Yujuan, et al. Simultaneous Determination of 7–ethyl–14–Aminocamptothecin and Metabolite in Rat by UPLC-MS/MS Method[J]. Advanced Engineering Sciences, 2018, 50(2): 226-230. DOI:10.15961/j.jsuese.201700661
UPLC-MS/MS法同时检测大鼠体内7–乙基–14–氨基喜树碱及其代谢产物
王万1,2, 廖立东2, 干玉娟2, 李晖1     
1. 四川大学 化学工程学院，四川 成都 610065;
2. 四川赛诺唯新生物技术有限公司，四川 成都 610023
收稿日期: 2017-05-15; 网络出版时间: 2018-03-18 23 : 07 : 38
作者简介: 王　万（1980—），男，博士生. 研究方向：生物化工.E-mail：myrid@foxmail.com
通讯联系人: E-mail：lihuilab@sina.com.
摘要: 7–乙基–14–氨基喜树碱（EAC）是具有良好抗肿瘤活性的新型喜树碱衍生物，为测定静脉注射EAC后原形化合物及其酰胺型代谢产物（EAC-M）在体内的浓度，揭示体内动力学性质，现研究建立了同时定量测定SD大鼠血浆中EAC和EAC-M的UPLC-MS/MS方法。以7–乙基–14–硝基喜树碱（ENC）、吉咪替康（CMT）为内标，血浆样品加入内标溶液和乙腈沉淀蛋白后，以Phenyl-Hexyl柱（2.1 mm $ \times $ 50 mm，1.8 μm）为分离柱，5 mmol/L醋酸铵水溶液（含0.1%甲酸）-乙腈为流动相梯度洗脱，流速0.5 mL/min。洗脱物经电喷雾离子源（ESI）正离子化，在三重四级杆质谱仪上以多反应监测模式（MRM）测定EAC（m/z 392→291）和EAC-M（392→290）。方法学研究结果显示，内源性物质不干扰待测物和内标的测定。在0.500～250 ng/mL范围内，EAC和EAC-M的浓度与响应值的线性关系良好，定量下限均为0.500 ng/mL。方法的日内、日间精密度（RSD）≤7.6%，准确度（RE）为–4.2%～5.9%。提取回收率为84.4%～98.7%，基质效应为94.8%～104%。高于定量上限浓度的样品，用空白血浆稀释6倍至线性范围，测得的精密度（RSD）为1.8%，准确度（RE ）为–10%～–3.0%。样品经设定的稳定性考察条件后，测得的准确度（RE）为–8.6%～11%，RSD<7.2%。药代动力学结果显示，静脉注射后EAC在大鼠体内的清除速率中等，组织分布高。给药后EAC-M在血浆中迅速检出，暴露量约相当于EAC的5%。连续给药5 d，EAC和EAC-M在大鼠体内无明显蓄积。所建立的方法简便、灵敏、选择性强，适用于SD大鼠血浆中EAC及代谢产物EAC-M的测定和药代动力学研究。
关键词: 7–乙基–14–氨基喜树碱    内酰胺代谢产物    大鼠血浆    超高效液相色谱–串联质谱    同时定量检测    
Simultaneous Determination of 7–ethyl–14–Aminocamptothecin and Metabolite in Rat by UPLC-MS/MS Method
WANG Wan1,2, LIAO Lidong2, GAN Yujuan2, LI Hui1     
1. College of Chemical Eng.,Sichuan Univ.,Chengdu 610065,China;
2. Sichuan Sino-innovation Bio-technology Co.,Ltd,Chengdu 610023,China
Abstract: 7–ethyl–14–Aminocamptothecin (EAC) is a novel derivate of camptothecin which exhibits favorable antitumor activity.To determine the concentrations of the parent drug and lactam form metabolite (EAC-M) in vivo after intravenous administration of EAC,an UPLC-MS/MS method was established to simultaneously quantify EAC and EAC-M in SD rat plasma.7–ethyl–14–Nitrocamptothecin (ENC) and Chimmitecan (CMT) were used as internal standards.After protein precipitation by adding solution of internal standards and acetonitrile,plasma samples were separated on a Phenyl-Hexyl colum (2.1mm $ \times $ 50 mm,1.8 μm) with the mobile phase consisting of 0.5 mmoL/L ammonium acetate solution (containing 0.1% formic acid)-acetonitrile.Gradient elution was employed at a flow rate of 0.5 mL/min.Eluted compounds were ionized by an electrospray ionization source (ESI) in positive mode.The parent to production transitions for both the parent drug (m/z 392→291) and the metabolite (m/z 392→290) were monitored on a triple quadrupole mass spectrometer,using the multiple reaction monitoring (MRM).Based on the results from method validation,no interference was observed in blank plasma samples.The linear ranges for EAC and EAC–M were 0.500～250 ng/mL,the limits of quantitation were 0.500 ng/mL.The inter- and intra-day precisions (RSD) were not more than 7.6%,the accuracies (RE) were –4.2%～5.9%.The extraction recovery values were 84.4%～98.7%,and the matrix effects were 94.8%～104%.Samples beyond the upper limits of quantification were analyzed after a 6–fold-dilution with blank plasma,the precisions (RSD) were 1.8%,and the accuracies (RE) were –10%～–3.0%.In stability tests,the accuracies (RE) were –8.6%～11% and the precisions (RSD) were blow 7.2%.Data from pharmacokinetic tests indicated that EAC is moderately cleaned and is widely distributed in tissues.EAC-M was rapidly detected in plasma after intravenous administration which showed a 5% exposure of EAC.No accumulation of EAC or EAC-M was observed after an administration for 5 consecutive days.In summary,the provided method is convenient,sensitive,selective,and suitable for investigation of EAC and EAC-M in pharmacokinetic research.
Key words: 7–ethyl–14–Aminocamptothecin    lactam metabolite    rat plasma    UPLC-MS/MS    simultaneous quantitative analysis    

喜树碱（CPT）是一种细胞毒类生物碱，于1966年首次从植物中分离得到[1]。因其具有显著的抗肿瘤活性，以及特异性抑制拓扑异构酶Ⅰ（TOP Ⅰ）的机理[2–3]而受到广泛关注，一度成为世界性研究热点。若干衍生物成功合成并应用于临床，在人类抗击肿瘤中发挥了重要作用[4–5]。近年，Duan等[6]在喜树碱D环进行氨基取代，得到了新型衍生物7–乙基–14–氨基喜树碱（EAC），如图1所示。与其他喜树碱衍生物相比，EAC抗肿瘤活性强，安全性高。但是，有关生物样本中EAC及其代谢产物的分析方法和应用研究尚未见报道。

作者基于超高效液相色谱–串联质谱方法（UPLC-MS/MS）具有高选择性、高灵敏度，尤其适合生物样本复杂体系中微量甚至痕量物质的定量分析等特点，建立了UPLC-MS/MS同时定量大鼠血浆中EAC及其内酰胺型代谢产物（EAC-M，图1）的分析方法，并应用于大鼠药代动力学试验。

图1 EAC、EAC-M、ENC与 CMT的化学结构 Fig. 1 Chemical structure for EAC, EAC-M, ENC and CMT

1 实验部分 1.1 药品和试剂

EAC（纯度99.2%）、EAC-M（纯度97.0%）、7–乙基–14–硝基喜树碱（ENC，纯度97.5%，用作EAC的内标）由实验室自行合成；吉咪替康（CMT，纯度94.7%，用作EAC-M的内标）由上海海和药物研究开发有限公司提供；甲醇、乙腈为色谱纯，购自德国Merck公司；醋酸铵为色谱纯，购自美国ROE公司；甲酸为色谱纯，购自德国Fluka公司；超纯水由法国Millipore公司纯水机制备。

标准溶液和质控样品溶液配制：精密称取EAC、EAC-M对照品各适量，分别用乙腈溶解成1.00 mg/mL的储备液。精密吸取等量的两种储备液混合，用含0.2%甲酸乙腈逐级稀释，得到不同浓度的混合标准工作液。再取混合标准工作液（20 μL）加入大鼠空白血浆（380 μL），得系列标准溶液，浓度分别为0.500、1.00、3.00、10.0、30.0、100和250 ng/mL。同法制备4份质控样品，浓度分别为0.500 ng/mL（定量下限，LLOQ）、1.50 ng/mL（低浓度质控，LQC）、20.0 ng/mL（中浓度质控，MQC）和200 ng/mL（高浓度质控，HQC）。

内标溶液配制：精密称取ENC、CMT对照品各适量，分别用乙腈溶解成1.00 mg/mL的内标储备液。精密吸取等量的两种内标储备液混合，以含0.2%甲酸乙腈稀释成浓度均为200 ng/mL内标溶液。

配制过程在避光条件下进行。QC及LLOQ样品于–70 ℃冰箱内保存备用，其余溶液在4 ℃冰箱内保存备用。

1.2 实验动物

SD大鼠，雌雄各半，体重180～260 g，购自上海西普尔–必凯实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（沪）2013-0016。饲养于中国科学院上海药物研究所，使用许可证号SYXK（沪）2010-0049。

1.3 仪器与分析条件

液相色谱–质谱联用仪：岛津高效液相色谱系统（日本Shimadzu公司），包含DGU–20A5在线脱气机、LC–30AD泵、SIL–30AC自动进样器、CTO–30A柱温箱；Qtrap5500三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾电离源（美国Applied Biosystems公司）。数据处理软件为Analyst 1.5.2（美国Applied Biosystems公司）。CT15RE型台式高速离心机（日本Hitachi公司）。H–101型多功能漩涡混合器（上海康禾光电仪器有限公司）。

液相色谱条件：Phenyl-Hexyl柱（2.1 mm $ \times $ 50 mm，1.8 μm，美国Agilent公司）；以5 mmol/L醋酸铵水溶液（含0.1%甲酸）为流动相A，乙腈为流动相B；梯度洗脱条件：0.0～0.6 min（25% B），0.6～0.8 min（25%～75%B），0.8～2.5 min（75%B），2.5～2.6 min（75%～25%B），2.6～3.5 min（25%B）；流速0.5 mL/min；进样量15 μL；自动进样器温度：4 ℃；柱温：室温。

MS/MS条件：ESI正离子方式检测；源喷射电压5 000 V；温度500 ℃；离子源气体1（N2）压力50 psi （344.738 kPa）；离子源气体2（N2）压力50 psi；气帘气体（N2）压力30 psi；扫描方式为多反应监测（MRM）；扫描时间100 ms；各成分的主要质谱参数及用于定量分析的母离子→子离子对见表1。

表1 MS/MS参数与定量分析的MRM离子对 Tab. 1 MS/MS parameters and MRM ions pair selected for quantitation

1.4 血浆样品处理

采用乙腈沉淀蛋白处理待测样品。取25.0 μL待测样品中加入25.0 μL内标溶液和125 μL含0.2%甲酸的乙腈，涡旋1 min，11 000 r/min离心5 min。取上清液100 μL，加入100 μL水，涡流混匀，吸取15.0 μL进行UPLC-MS/MS分析。

1.5 大鼠体内药代动力学试验

SD大鼠随机分成2组，每组6只，雌雄各半。EAC溶解于HS15–丙二醇–乙醇–生理盐水（体积比7∶10∶5∶78）并经孔径0.22 μm的滤膜过滤。

第1组单次尾静脉给予0.8 mg/kg EAC，于给药前和给药后0.083、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0 h经眼球后静脉丛取血0.2 mL。第2组按0.8 mg/kg，1次/天，连续尾静脉给药5天。第5天于给药前和给药后0.083、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0 h经眼球后静脉丛取血0.2 mL。血样置EDTA抗凝试管中，11 000 r/min离心5 min，分离血浆，–70 ℃保存待测。

测得数据后，利用Phoenix 1.3软件（美国Pharsight公司）的非房室模型计算药代动力学参数。

2 结果与讨论 2.1 方法选择性

在ESI+方式下，EAC、EAC-M、ENC、CMT分别主要生成m/z为392、392、422和405的[M+H]+峰。选择性对这些基峰离子进行产物离子全扫描分析，EAC、EAC-M、ENC及CMT生成的碎片离子中，丰度较高的分别为m/z 291、290、357和361，将其作为定量分析时监测的产物离子；EAC、EAC-M、ENC和CMT的保留时间分别约为2.5、2.1、2.7和2.1 min。结合MS/MS的选择性和UPLC保留时间的差别，对各组份进行定位和归属。

与空白血浆样品的色谱图比较，大鼠空白血浆样品中内源性物质不干扰待测物和内标的检测。结果如图2所示。

图2 血浆中待测物与内标的典型MRM图谱 Fig. 2 Represent chromatograms of analytes and internal standards in plasma samples

2.2 标准曲线和定量下限

样品按第1.4节方法处理。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权（W=1/x2）最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程。EAC的回归方程为y=0.011 5x–0.001 47 （R2=0.994 4），EAC-M的回归方程为y=0.003 31x+0.000 721 （R2=0.994 8）。结果表明，在0.500～250 ng/mL范围内，EAC和EAC-M的浓度与响应值线性关系良好，两者的定量下限均为0.500 ng/mL。

2.3 方法的精密度与准确度

取不同浓度的质控样品（HQC、MQC、LQC、LLOQ），每一浓度进行6样本分析，根据当日的标准曲线计算，结果如表2所示。

表2 精密度与准确度结果 Tab. 2 Results of Precision and accuracy

结果表明，各浓度质控样品中EAC与EAC-M的准确度（RE）为–4.2%～5.9%，日内精密度（RSD）和日间精密度（RSD）≤7.6%，结果均在可接受限度内。

2.4 提取回收率与基质效应

取LQC、MQC、HQC按照第1.4节方法处理，进样测定。另取空白血浆按第1.4节方法处理（不加内标）后，加入待测物、内标。每一浓度进行6样本分析，以前、后两种方法测得峰面积的比值计算回收率。

取6只大鼠空白血浆在低（1.50 ng/mL）、高（200 ng/mL）2个浓度下考察基质效应。空白血浆按第1.4节方法处理（不加内标）后，加入待测物、内标，测得待测物峰面积 $ A_{ p}$ 、内标峰面积 $ I_{ p}$ 。同时，用水代替空白血浆同法上述操作，测得待测物峰面积 $ A_{ a}$ 、内标峰面积 $ I_{ a}$ ，按式（1）计算内标归一化基质因子MFn。

$M{F_{ n}} = {A_{ p}} \times {I_{ a}}/\left( {{A_{ a}} \times {I_{ p}}} \right)$ (1)

回收率与基质效应测试结果见表3。

表3 回收率与血浆基质效应结果 Tab. 3 Extration recovery and matrix effects in plasma

由测试结果可见，各组份在低、中、高3个浓度的回收率为84.4%～98.7%。各组份在每一浓度水平下基质效应的RSD≤5%，基质对本方法的影响可以忽略。

2.5 稀释试验

6份浓度为1 200 ng/mL的质控样品经空白血浆稀释6倍后进行分析，EAC测得值的精密度（RSD）和准确度（RE）分别为1.8%、–10%，EAC-M测得值的精密度（RSD）和准确度（RE）分别为1.8%、–3.0%。结果表明，样品经空白血浆稀释6倍后不影响结果的准确性。

2.6 样品稳定性考察

取低（1.50 ng/mL）、高（200 ng/mL）2个浓度的全血样品和血浆样品，低（10.0 ng/mL）、高（5 000 ng/mL）2个浓度的标准溶液，以及标准储备液进行稳定性考察。分别考察全血样品室温放置2 h、血浆样品室温放置4 h、血浆样品经历3次冻融、血浆样品–70 ℃放置27 d、血浆样品预处理后4 ℃放置24 h、储备液和标准溶液在4 ℃放置30 d、储备液和标准溶液在室温放置6 h的稳定性。每一浓度进行3样本分析。

结果表明，EAC的准确度（RE）为–4.0%～11%，RSD小于7.2%；EAC-M的准确度（RE）为–8.6%～6.2%，RSD小于5.9%。说明EAC和EAC-M在上述条件下均稳定。

2.7 药动学试验

将所建立的UPLC-MS/MS方法应用于SD大鼠药代动力学试验，血浆样品中分析物的代表性MRM图谱见图2（d）。SD大鼠以0.8 mg/kg单次静脉给药、连续5 d多次静脉给药（1次/d）后，血浆中EAC和EAC-M的药–时曲线见图3，药代动力学参数见表4。

图3 大鼠静脉给药后EAC和EAC-M的平均药–时曲线 Fig. 3 Mean plasma concentration-time profiles of EAC and EAC-M after intravenous administration in rats

表4 大鼠单次及多次给药0.8 mg/kg后药动学参数 Tab. 4 Pharmacokinetic parameters after single or repeated dose of 0.8 mg/kg EAC in rats

结果显示，SD大鼠静脉注射EAC后，血浆清除率（CL）相当于大鼠肝脏血流量（约55 mL/（min·kg–1）的60.9%，稳态分布容积（Vss）为大鼠体液总量（约0.67 L/kg）的2.40倍，表明EAC在大鼠体内的清除速率中等，组织分布高。给药后，代谢产物EAC-M在血浆中迅速检出，血浆中的暴露量约相当于EAC的5%。连续给药5 d，EAC和EAC-M的AUC0-t与单次给药无明显差别，表明在大鼠体内无明显蓄积。

3 结　论

研究建立了UPLC-MS/MS方法，大鼠血浆样品仅需一步沉淀处理后进样，可同时对EAC及其代谢产物EAC-M进行定性、定量分析。单个样品分析时间仅需3.5 min，具有较高的样品通量。经验证，该方法分离度好、灵敏度高、专属性强、准确度和精密度良好，符合生物样品分析的要求[7–8]。

应用所建立的分析方法开展SD大鼠药代动力学研究，揭示了EAC及其代谢产物EAC-M的体内药动学性质，可以为后续临床研究提供参考。

参考文献
[1]
Wall M E, Wani M C, Cook C E. Plant antitumor agents.I:The isolation and structure of camptothecin,a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor from camptotheca acuminate[J]. Journal of the American Chemical Society, 1966, 88(16): 3888-3890. DOI:10.1021/ja00968a057
[2]
Hisang Y H, Hertzberg R, Hecht S. Campothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase I[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1985, 260(27): 14873-14878.
[3]
Liu L F, Duann P, Lin C T. Mechanism of action of camptothecin[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 1996, 803(1): 44-49.
[4]
Oberlies N H, Kroll D J. Camptothecin and taxol:Historic achievements in natural products research[J]. Journal of Natural Products, 2004, 67(2): 129-135. DOI:10.1021/np030498t
[5]
Garciacarbonero R, Supko J G. Current perspectives on the clinical experience,pharmacology,and continued development of the camptothecins[J]. Clinical Cancer Research, 2002, 8(3): 641-661.
[6]
Duan Jianxin, Cai Xiaohong, Meng Fanyin. 14-Aminocamptothecins:Their synthesis,preclinical activity,and potential use for cancer treatment[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2011, 54(6): 1715-1723. DOI:10.1021/jm101354u
[7]
Shah V P, Midha K K, Findlay J W. Bioanalytical method validation:A revisit with a decade of progress[J]. Pharmaceutical Research, 2000, 17(12): 1551. DOI:10.1023/A:1007669411738
[8]
Viswanathan C T, Bansal S, Booth B. Quantitative bioanalytical methods validation and implementation:Best practices for chromatographic and ligand binding assays[J]. Pharmaceutical Research, 2007, 24(10): 1962-1973. DOI:10.1007/s11095-007-9291-7