工程科学与技术   2018, Vol. 50 Issue (2): 226-230
UPLC-MS/MS法同时检测大鼠体内7–乙基–14–氨基喜树碱及其代谢产物
王万1,2, 廖立东2, 干玉娟2, 李晖1     
1. 四川大学 化学工程学院,四川 成都 610065;
2. 四川赛诺唯新生物技术有限公司,四川 成都 610023
摘要: 7–乙基–14–氨基喜树碱(EAC)是具有良好抗肿瘤活性的新型喜树碱衍生物,为测定静脉注射EAC后原形化合物及其酰胺型代谢产物(EAC-M)在体内的浓度,揭示体内动力学性质,现研究建立了同时定量测定SD大鼠血浆中EAC和EAC-M的UPLC-MS/MS方法。以7–乙基–14–硝基喜树碱(ENC)、吉咪替康(CMT)为内标,血浆样品加入内标溶液和乙腈沉淀蛋白后,以Phenyl-Hexyl柱(2.1 mm $ \times $ 50 mm,1.8 μm)为分离柱,5 mmol/L醋酸铵水溶液(含0.1%甲酸)-乙腈为流动相梯度洗脱,流速0.5 mL/min。洗脱物经电喷雾离子源(ESI)正离子化,在三重四级杆质谱仪上以多反应监测模式(MRM)测定EAC(m/z 392→291)和EAC-M(392→290)。方法学研究结果显示,内源性物质不干扰待测物和内标的测定。在0.500~250 ng/mL范围内,EAC和EAC-M的浓度与响应值的线性关系良好,定量下限均为0.500 ng/mL。方法的日内、日间精密度(RSD)≤7.6%,准确度(RE)为–4.2%~5.9%。提取回收率为84.4%~98.7%,基质效应为94.8%~104%。高于定量上限浓度的样品,用空白血浆稀释6倍至线性范围,测得的精密度(RSD)为1.8%,准确度(RE )为–10%~–3.0%。样品经设定的稳定性考察条件后,测得的准确度(RE)为–8.6%~11%,RSD<7.2%。药代动力学结果显示,静脉注射后EAC在大鼠体内的清除速率中等,组织分布高。给药后EAC-M在血浆中迅速检出,暴露量约相当于EAC的5%。连续给药5 d,EAC和EAC-M在大鼠体内无明显蓄积。所建立的方法简便、灵敏、选择性强,适用于SD大鼠血浆中EAC及代谢产物EAC-M的测定和药代动力学研究。
关键词: 7–乙基–14–氨基喜树碱    内酰胺代谢产物    大鼠血浆    超高效液相色谱–串联质谱    同时定量检测    
Simultaneous Determination of 7–ethyl–14–Aminocamptothecin and Metabolite in Rat by UPLC-MS/MS Method
WANG Wan1,2, LIAO Lidong2, GAN Yujuan2, LI Hui1     
1. College of Chemical Eng.,Sichuan Univ.,Chengdu 610065,China;
2. Sichuan Sino-innovation Bio-technology Co.,Ltd,Chengdu 610023,China
Abstract: 7–ethyl–14–Aminocamptothecin (EAC) is a novel derivate of camptothecin which exhibits favorable antitumor activity.To determine the concentrations of the parent drug and lactam form metabolite (EAC-M) in vivo after intravenous administration of EAC,an UPLC-MS/MS method was established to simultaneously quantify EAC and EAC-M in SD rat plasma.7–ethyl–14–Nitrocamptothecin (ENC) and Chimmitecan (CMT) were used as internal standards.After protein precipitation by adding solution of internal standards and acetonitrile,plasma samples were separated on a Phenyl-Hexyl colum (2.1mm $ \times $ 50 mm,1.8 μm) with the mobile phase consisting of 0.5 mmoL/L ammonium acetate solution (containing 0.1% formic acid)-acetonitrile.Gradient elution was employed at a flow rate of 0.5 mL/min.Eluted compounds were ionized by an electrospray ionization source (ESI) in positive mode.The parent to production transitions for both the parent drug (m/z 392→291) and the metabolite (m/z 392→290) were monitored on a triple quadrupole mass spectrometer,using the multiple reaction monitoring (MRM).Based on the results from method validation,no interference was observed in blank plasma samples.The linear ranges for EAC and EAC–M were 0.500~250 ng/mL,the limits of quantitation were 0.500 ng/mL.The inter- and intra-day precisions (RSD) were not more than 7.6%,the accuracies (RE) were –4.2%~5.9%.The extraction recovery values were 84.4%~98.7%,and the matrix effects were 94.8%~104%.Samples beyond the upper limits of quantification were analyzed after a 6–fold-dilution with blank plasma,the precisions (RSD) were 1.8%,and the accuracies (RE) were –10%~–3.0%.In stability tests,the accuracies (RE) were –8.6%~11% and the precisions (RSD) were blow 7.2%.Data from pharmacokinetic tests indicated that EAC is moderately cleaned and is widely distributed in tissues.EAC-M was rapidly detected in plasma after intravenous administration which showed a 5% exposure of EAC.No accumulation of EAC or EAC-M was observed after an administration for 5 consecutive days.In summary,the provided method is convenient,sensitive,selective,and suitable for investigation of EAC and EAC-M in pharmacokinetic research.
Key words: 7–ethyl–14–Aminocamptothecin    lactam metabolite    rat plasma    UPLC-MS/MS    simultaneous quantitative analysis    

喜树碱(CPT)是一种细胞毒类生物碱,于1966年首次从植物中分离得到[1]。因其具有显著的抗肿瘤活性,以及特异性抑制拓扑异构酶Ⅰ(TOP Ⅰ)的机理[23]而受到广泛关注,一度成为世界性研究热点。若干衍生物成功合成并应用于临床,在人类抗击肿瘤中发挥了重要作用[45]。近年,Duan等[6]在喜树碱D环进行氨基取代,得到了新型衍生物7–乙基–14–氨基喜树碱(EAC),如图1所示。与其他喜树碱衍生物相比,EAC抗肿瘤活性强,安全性高。但是,有关生物样本中EAC及其代谢产物的分析方法和应用研究尚未见报道。

作者基于超高效液相色谱–串联质谱方法(UPLC-MS/MS)具有高选择性、高灵敏度,尤其适合生物样本复杂体系中微量甚至痕量物质的定量分析等特点,建立了UPLC-MS/MS同时定量大鼠血浆中EAC及其内酰胺型代谢产物(EAC-M,图1)的分析方法,并应用于大鼠药代动力学试验。

图1 EAC、EAC-M、ENC与 CMT的化学结构 Fig. 1 Chemical structure for EAC, EAC-M, ENC and CMT

1 实验部分 1.1 药品和试剂

EAC(纯度99.2%)、EAC-M(纯度97.0%)、7–乙基–14–硝基喜树碱(ENC,纯度97.5%,用作EAC的内标)由实验室自行合成;吉咪替康(CMT,纯度94.7%,用作EAC-M的内标)由上海海和药物研究开发有限公司提供;甲醇、乙腈为色谱纯,购自德国Merck公司;醋酸铵为色谱纯,购自美国ROE公司;甲酸为色谱纯,购自德国Fluka公司;超纯水由法国Millipore公司纯水机制备。

标准溶液和质控样品溶液配制:精密称取EAC、EAC-M对照品各适量,分别用乙腈溶解成1.00 mg/mL的储备液。精密吸取等量的两种储备液混合,用含0.2%甲酸乙腈逐级稀释,得到不同浓度的混合标准工作液。再取混合标准工作液(20 μL)加入大鼠空白血浆(380 μL),得系列标准溶液,浓度分别为0.500、1.00、3.00、10.0、30.0、100和250 ng/mL。同法制备4份质控样品,浓度分别为0.500 ng/mL(定量下限,LLOQ)、1.50 ng/mL(低浓度质控,LQC)、20.0 ng/mL(中浓度质控,MQC)和200 ng/mL(高浓度质控,HQC)。

内标溶液配制:精密称取ENC、CMT对照品各适量,分别用乙腈溶解成1.00 mg/mL的内标储备液。精密吸取等量的两种内标储备液混合,以含0.2%甲酸乙腈稀释成浓度均为200 ng/mL内标溶液。

配制过程在避光条件下进行。QC及LLOQ样品于–70 ℃冰箱内保存备用,其余溶液在4 ℃冰箱内保存备用。

1.2 实验动物

SD大鼠,雌雄各半,体重180~260 g,购自上海西普尔–必凯实验动物有限公司,生产许可证号SCXK(沪)2013-0016。饲养于中国科学院上海药物研究所,使用许可证号SYXK(沪)2010-0049。

1.3 仪器与分析条件

液相色谱–质谱联用仪:岛津高效液相色谱系统(日本Shimadzu公司),包含DGU–20A5在线脱气机、LC–30AD泵、SIL–30AC自动进样器、CTO–30A柱温箱;Qtrap5500三重四极杆串联质谱仪,配备电喷雾电离源(美国Applied Biosystems公司)。数据处理软件为Analyst 1.5.2(美国Applied Biosystems公司)。CT15RE型台式高速离心机(日本Hitachi公司)。H–101型多功能漩涡混合器(上海康禾光电仪器有限公司)。

液相色谱条件:Phenyl-Hexyl柱(2.1 mm $ \times $ 50 mm,1.8 μm,美国Agilent公司);以5 mmol/L醋酸铵水溶液(含0.1%甲酸)为流动相A,乙腈为流动相B;梯度洗脱条件:0.0~0.6 min(25% B),0.6~0.8 min(25%~75%B),0.8~2.5 min(75%B),2.5~2.6 min(75%~25%B),2.6~3.5 min(25%B);流速0.5 mL/min;进样量15 μL;自动进样器温度:4 ℃;柱温:室温。

MS/MS条件:ESI正离子方式检测;源喷射电压5 000 V;温度500 ℃;离子源气体1(N2)压力50 psi (344.738 kPa);离子源气体2(N2)压力50 psi;气帘气体(N2)压力30 psi;扫描方式为多反应监测(MRM);扫描时间100 ms;各成分的主要质谱参数及用于定量分析的母离子→子离子对见表1

表1 MS/MS参数与定量分析的MRM离子对 Tab. 1 MS/MS parameters and MRM ions pair selected for quantitation

1.4 血浆样品处理

采用乙腈沉淀蛋白处理待测样品。取25.0 μL待测样品中加入25.0 μL内标溶液和125 μL含0.2%甲酸的乙腈,涡旋1 min,11 000 r/min离心5 min。取上清液100 μL,加入100 μL水,涡流混匀,吸取15.0 μL进行UPLC-MS/MS分析。

1.5 大鼠体内药代动力学试验

SD大鼠随机分成2组,每组6只,雌雄各半。EAC溶解于HS15–丙二醇–乙醇–生理盐水(体积比7∶10∶5∶78)并经孔径0.22 μm的滤膜过滤。

第1组单次尾静脉给予0.8 mg/kg EAC,于给药前和给药后0.083、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0 h经眼球后静脉丛取血0.2 mL。第2组按0.8 mg/kg,1次/天,连续尾静脉给药5天。第5天于给药前和给药后0.083、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0 h经眼球后静脉丛取血0.2 mL。血样置EDTA抗凝试管中,11 000 r/min离心5 min,分离血浆,–70 ℃保存待测。

测得数据后,利用Phoenix 1.3软件(美国Pharsight公司)的非房室模型计算药代动力学参数。

2 结果与讨论 2.1 方法选择性

在ESI+方式下,EAC、EAC-M、ENC、CMT分别主要生成m/z为392、392、422和405的[M+H]+峰。选择性对这些基峰离子进行产物离子全扫描分析,EAC、EAC-M、ENC及CMT生成的碎片离子中,丰度较高的分别为m/z 291、290、357和361,将其作为定量分析时监测的产物离子;EAC、EAC-M、ENC和CMT的保留时间分别约为2.5、2.1、2.7和2.1 min。结合MS/MS的选择性和UPLC保留时间的差别,对各组份进行定位和归属。

与空白血浆样品的色谱图比较,大鼠空白血浆样品中内源性物质不干扰待测物和内标的检测。结果如图2所示。

图2 血浆中待测物与内标的典型MRM图谱 Fig. 2 Represent chromatograms of analytes and internal standards in plasma samples

2.2 标准曲线和定量下限

样品按第1.4节方法处理。以待测物浓度为横坐标,待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标,用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算,求得直线回归方程。EAC的回归方程为y=0.011 5x–0.001 47 (R2=0.994 4),EAC-M的回归方程为y=0.003 31x+0.000 721 (R2=0.994 8)。结果表明,在0.500~250 ng/mL范围内,EAC和EAC-M的浓度与响应值线性关系良好,两者的定量下限均为0.500 ng/mL。

2.3 方法的精密度与准确度

取不同浓度的质控样品(HQC、MQC、LQC、LLOQ),每一浓度进行6样本分析,根据当日的标准曲线计算,结果如表2所示。

表2 精密度与准确度结果 Tab. 2 Results of Precision and accuracy

结果表明,各浓度质控样品中EAC与EAC-M的准确度(RE)为–4.2%~5.9%,日内精密度(RSD)和日间精密度(RSD)≤7.6%,结果均在可接受限度内。

2.4 提取回收率与基质效应

取LQC、MQC、HQC按照第1.4节方法处理,进样测定。另取空白血浆按第1.4节方法处理(不加内标)后,加入待测物、内标。每一浓度进行6样本分析,以前、后两种方法测得峰面积的比值计算回收率。

取6只大鼠空白血浆在低(1.50 ng/mL)、高(200 ng/mL)2个浓度下考察基质效应。空白血浆按第1.4节方法处理(不加内标)后,加入待测物、内标,测得待测物峰面积 $ A_{ p}$ 、内标峰面积 $ I_{ p}$ 。同时,用水代替空白血浆同法上述操作,测得待测物峰面积 $ A_{ a}$ 、内标峰面积 $ I_{ a}$ ,按式(1)计算内标归一化基质因子MFn

$M{F_{ n}} = {A_{ p}} \times {I_{ a}}/\left( {{A_{ a}} \times {I_{ p}}} \right)$ (1)

回收率与基质效应测试结果见表3

表3 回收率与血浆基质效应结果 Tab. 3 Extration recovery and matrix effects in plasma

由测试结果可见,各组份在低、中、高3个浓度的回收率为84.4%~98.7%。各组份在每一浓度水平下基质效应的RSD≤5%,基质对本方法的影响可以忽略。

2.5 稀释试验

6份浓度为1 200 ng/mL的质控样品经空白血浆稀释6倍后进行分析,EAC测得值的精密度(RSD)和准确度(RE)分别为1.8%、–10%,EAC-M测得值的精密度(RSD)和准确度(RE)分别为1.8%、–3.0%。结果表明,样品经空白血浆稀释6倍后不影响结果的准确性。

2.6 样品稳定性考察

取低(1.50 ng/mL)、高(200 ng/mL)2个浓度的全血样品和血浆样品,低(10.0 ng/mL)、高(5 000 ng/mL)2个浓度的标准溶液,以及标准储备液进行稳定性考察。分别考察全血样品室温放置2 h、血浆样品室温放置4 h、血浆样品经历3次冻融、血浆样品–70 ℃放置27 d、血浆样品预处理后4 ℃放置24 h、储备液和标准溶液在4 ℃放置30 d、储备液和标准溶液在室温放置6 h的稳定性。每一浓度进行3样本分析。

结果表明,EAC的准确度(RE)为–4.0%~11%,RSD小于7.2%;EAC-M的准确度(RE)为–8.6%~6.2%,RSD小于5.9%。说明EAC和EAC-M在上述条件下均稳定。

2.7 药动学试验

将所建立的UPLC-MS/MS方法应用于SD大鼠药代动力学试验,血浆样品中分析物的代表性MRM图谱见图2(d)。SD大鼠以0.8 mg/kg单次静脉给药、连续5 d多次静脉给药(1次/d)后,血浆中EAC和EAC-M的药–时曲线见图3,药代动力学参数见表4

图3 大鼠静脉给药后EAC和EAC-M的平均药–时曲线 Fig. 3 Mean plasma concentration-time profiles of EAC and EAC-M after intravenous administration in rats

表4 大鼠单次及多次给药0.8 mg/kg后药动学参数 Tab. 4 Pharmacokinetic parameters after single or repeated dose of 0.8 mg/kg EAC in rats

结果显示,SD大鼠静脉注射EAC后,血浆清除率(CL)相当于大鼠肝脏血流量(约55 mL/(min·kg–1)的60.9%,稳态分布容积(Vss)为大鼠体液总量(约0.67 L/kg)的2.40倍,表明EAC在大鼠体内的清除速率中等,组织分布高。给药后,代谢产物EAC-M在血浆中迅速检出,血浆中的暴露量约相当于EAC的5%。连续给药5 d,EAC和EAC-M的AUC0-t与单次给药无明显差别,表明在大鼠体内无明显蓄积。

3 结 论

研究建立了UPLC-MS/MS方法,大鼠血浆样品仅需一步沉淀处理后进样,可同时对EAC及其代谢产物EAC-M进行定性、定量分析。单个样品分析时间仅需3.5 min,具有较高的样品通量。经验证,该方法分离度好、灵敏度高、专属性强、准确度和精密度良好,符合生物样品分析的要求[78]

应用所建立的分析方法开展SD大鼠药代动力学研究,揭示了EAC及其代谢产物EAC-M的体内药动学性质,可以为后续临床研究提供参考。

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